蛋白质印迹手册2:蛋白质结合

【字体: 时间:2014年05月20日 来源:默克密理博

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  一旦膜被浸湿,蛋白质结合可通过蛋白质与膜的接触而实现。由于蛋白与膜结合的发生贯穿整个膜的厚度(深度),结合能力是由孔的内部表面积来决定的。Immobilon®-P与Immobilon®-PSQ转印膜在蛋白结合能力上有何差异?影响蛋白质结合的因素有哪些?请看本文。

PVDF本质是一种疏水性的聚合物,在水溶液中不会浸湿。为了在水性缓冲液和系统中使用PVDF膜,首先必须将其浸泡在50%(v/v)或更高浓度的醇溶液中。甲醇、乙醇和异丙醇都适合浸泡这种膜。随着膜的外观从不透明到半透明,完全浸湿是显而易见的。之后必须用水反复冲洗,以去除醇类,再将膜直接放入转印缓冲液中平衡。

Immobilon®-P vs. Immobilon®-PSQ转印膜

一旦膜被浸湿,蛋白质结合可通过蛋白质与膜的接触而实现。由于蛋白与膜结合的发生贯穿整个膜的厚度(深度),结合能力是由孔的内部表面积来决定的(Mansfield,1994)。Immobilon®-PSQ转印膜的内部表面积大约是Immobilon®-P转印膜的三倍,使其吸附能力更高(表2)。表2中所列的数值代表了膜表面在非变性缓冲液中饱和后蛋白质结合的上限。在任一指定的应用中,都可以预期Immobilon®-PSQ转印膜能比Immobilon®-P转印膜结合更多的蛋白质。

然而,分析中可实现的最大结合能力往往取决于所采用的具体操作步骤,这是由于蛋白质构象的差异,所使用缓冲液的化学性质,以及样品上样所用方法的限制。

Immobilon®-P与Immobilon®-PSQ转印膜之间结合差异的例子如图1所示,其中蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶上电转过来。部分蛋白质穿过Immobilon®-P转印膜,被第一张膜后面的第二张膜所捕获。相比之下,所有蛋白质与Immobilon®-PSQ转印膜结合,而未穿过。在这种情况下,紧密的孔结构和聚合物较高的内部表面积有助于所有转移蛋白的完全吸附。不过,Immobilon®-PSQ转印膜上的免疫检测可能产生较高的背景,需要更严格的清洗条件。因此,膜的选择是由实验目标决定的:对于>20 kDa蛋白质的高灵敏度检测,使用Immobilon®-P转印膜,但如果分析较小的蛋白质,或必须捕获100%的蛋白质进行肽段测序,则要转换成Immobilon®-PSQ转印膜。

图1. 利用Immobilon®-P和Immobilon®-PSQ转印膜进行蛋白质的延长电转。分子量标准品(第1、3、5、7泳道)和小牛肝裂解液(第2、4、6、8泳道)通过槽转印法转移到Immobilon®-P或Immobilon®-PSQ膜,并用考马斯亮蓝染色。在第一张Immobilon®-PSQ转印膜的后面再放一张,以捕获穿过的蛋白质。(第5和6泳道在Immobilon®-P后面;第7和8泳道在Immobilon®-PSQ后面。)

影响蛋白质结合的因素

在分子水平,蛋白质吸附至少部分源于疏水氨基酸侧链与聚合物表面疏水区的相互作用。Matsudaira(1987)观察到,在疏水残基被切割之后,小肽的测序效率下降80%,这可能是由于残余肽段被洗脱。同时,在肽段消化降解时,人们也观察到疏水肽段往往不能像亲水肽段那样高效洗脱(如Iwamatsu,1991;Fernandez等,1992)。McKeon和Lyman(1991)表明,转印缓冲液中添加的Ca2+离子可增强钙调蛋白与Immobilon®-P转印膜的结合。钙的结合导致蛋白质分子结构中形成一个疏水袋。

(实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准,如有错漏,敬请谅解)

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